کلون سازی، بیان و تعیین خصوصیات فتوپروتئین photina و تغییر طیف بیولومینسانسی آن با استفاده از جهش زایی هدفدار

امروزه استفاده از فتوپروتئین ها به واسطه سیگنال کم پس زمینه ای جایگاهی ویژه یافته است. در بین فتوپروتئین های رایج، اکثر مطالعات روی فتوپروتئین اکورین متمرکز شده است. در سال های اخیر محققین شرکت axxam سه فتوپروتئین ارتقاء یافته به نام های photina، i-photina و c-photina تولید کردند. این فتوپروتئین ها به واسطه سیگنال دهی قوی و نیز بادوام تر خود نسبت به اکورین، دریچه ی نوینی را به روی کاربرد بیولومینسانس در سنجش های hts گشوده اند و درحال حاضر فرم تجاری این سه فتوپروتئین توسط شرکت های مختلفی عرضه می گردد. در این تحقیق فتوپروتئین i-photina به دلیل شدت سیگنال بالاتر و همچنین پایداری نسبتاً مناسب آن نسبت به دو فتوپروتئین دیگر جهت مطالعه و نیز تولید واریانت هایی از آن با خصوصیات بهبود یافته از جمله تغییر در طول موج نشری انتخاب گردید. این مهم تا حدودی با ایجاد موتانت هایی از i-photina (f91y و w95f) محقق شد. ابتدا ترجیح کدونی ژن i-photina براساس سلول های پستانداران و e. coli تنظیم گردید. سپس توالی مربوطه سنتز و در باکتری e. coli بیان شد. در مرحله بعد جهش زایی به روش quikchange انجام شد. در نهایت خصوصیات بیولومینسانسی فتوپروتئین های اکورین، i-photina و جهش یافته ها و نیز ساختار آن ها با روش های مختلف تجربی و تئوری مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت. شدت سیگنال i-photina نسبت به اکورین نزدیک به 14 برابر به دست آمد. تغییر خصوصیات بیولومینسانسی در جهش یافته های f91y و w95f به ترتیب شامل 20 و 10 نانومتر جابه جایی طیف نشری به سمت طول موج های کوتاه تر، 30% افزایش و 80% کاهش در شدت سیگنال نشری و نیز افزایش میزان حساسیت به کلسیم و مدت زمان نوردهی در هر دو جهش یافته نسبت به i-photina بود. با توجه به بهبود بسیاری از خصوصیات بیولومینسانسی جهش یافته f91y، می توان آن را به عنوان یک گزارشگر بیولومینسانسی بسیار کارآمد در سنجش های hts و نیز سنجش های همزمان نسبت به سایر فتوپروتئین های رایج از جمله اکورین و نیز i-photina مطرح نمود.